Thèse Année : 2002

Crystallographic and functional study of barley α-amylase isozymes: their 3D structures reveals separate modes in polysaccharides recognition and suggest new inhibitors

Étude cristallographique et fonctionnelle des isoenzymes de l’α-amylase d’orge : leurs structures 3D en action révèlent des modes distincts de reconnaissance des polysaccharides et de nouvelles molécules inhibitrices

Résumé

Barley grains contain two isozymes from the alpha-amylase family (namely AMY1 and AMY2) which are implicated in the degradation of starch, necessary for plant embryo growth. The three dimensional structure of AMY2 (solved by X-Ray crystallography) is known in its native state, in complex with acarbose (a pseudo-tetrasaccharide inhibitor) and also with the proteinaous bifunctional endogen inhibitor BASI. Despite their high sequence similarities, AMY1 and AMY2 can be distinguished in several aspects: isoelectric point, stability at acidic pH or elevated temperature, affinity for calcium ions or soluble substrates, distinct efficiency in starch granule hydrolysis. Finally, only AMY2 is inhibited by BASI. This study presents the native structure of AMY1, solved by X-Ray crystallography, and the comparative analysis of the two isozymes, in order to explain their remarkable differences in properties. Solved structures of complexes with acarbose and substrates analogues give also insight in AMY1 hydrolysis and inhibition mechanisms. Moreover, the structural complex between AMY1 and a natural substrate (maltoheptaose) has led us to analyse the different substrate binding subsites and to identify a new surface site with the ability to bind polysaccharides. This site, only present in AMY1, reveals for the first time, the role of an alpha-amylase domain C. Finally, the discovery of a new potential class of glycosidase inhibitors from the polyamine chemical family is presented. An AMY1/spermidine complex has shown that the polyamine binds preferentially in the active site, even in presence of acarbose. This property could be extended to others alpha-amylases (notably human) and provides the basis for the design of new inhibitors of potential interest for therapeutic applications.
Le grain d’orge contient deux isoenzymes de la famille des alpha-amylases (AMY1 et AMY2) qui sont impliqués dans la dégradation de l’amidon nécessaire à la croissance de l’embryon de plante. La structure tridimensionnelle de AMY2 (résolue par cristallographie et diffraction des rayons X) est connue dans son état natif, mais aussi en complexe, d’une part avec l’acarbose (un pseudo-tétrasaccharide inhibiteur) et d’autre part avec l’inhibiteur protéique bifonctionnel endogène BASI. Malgré leur très grande similitude de séquence, AMY1 et AMY2 se distinguent à plusieurs niveaux : point isoélectrique, stabilité à pH acide ou à haute température, affinité pour les ions calcium et pour les substrats solubles, efficacité différente pour l’hydrolyse des granules d’amidon. Enfin, seul AMY2 est inhibé par BASI. Cette étude présente la structure native de AMY1, résolue par cristallographie, et l’analyse comparée des deux isoenzymes, en vue d’expliquer leurs remarquables différences de propriétés. La résolution des structures des complexes avec l’acarbose et des analogues de substrat fournit également des informations sur les mécanismes d’hydrolyse et d’inhibition de AMY1. De plus, la structure d’un complexe entre AMY1 et un substrat naturel (maltoheptaose) nous a permis d’étudier en détail les différents sous-sites de fixation du substrat à l’enzyme et d’identifier un nouveau site de surface pouvant lier des polysaccharides. Ce site, présent uniquement chez AMY1, révèle pour la première fois, le rôle du domaine C d’une alpha-amylase. Enfin, la découverte d’une nouvelle classe potentielle d’inhibiteurs de glycosidases de type polyamine est présentée. Un complexe AMY1/spermidine a montré que la polyamine se fixait préférentiellement dans le site actif, même en présence d’acarbose. Cette propriété semble pouvoir s’étendre à d’autres alpha-amylases (notamment humaine) et servir de base à la conception de nouveaux inhibiteurs à visées thérapeutiques.
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Xavier Robert. Étude cristallographique et fonctionnelle des isoenzymes de l’α-amylase d’orge : leurs structures 3D en action révèlent des modes distincts de reconnaissance des polysaccharides et de nouvelles molécules inhibitrices. Biologie structurale [q-bio.BM]. Université Claude Bernard Lyon 1, 2002. Français. ⟨NNT : 2002LYO10059⟩. ⟨tel-04914984⟩
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